Górnośląskie Centrum Obliczeń Naukowych i Inżynierskich

Jedną z powszechnie znanych metod wizualizacji wewnątrzkomórkowych organelli jest transmisyjna mikroskopia elektronowa. Za pomocą odpowiednio dobranej techniki znakowania przeciwciałami oraz dalszego znakowania cząsteczkami złota, otrzymuje się przestrzenny obraz struktur i molekuł komórkowych. Opracowany protokół eksperymentalny, na podstawie którego otrzymuje się zestaw wyznakowanych preparatów mikroskopowych, pozwala również na zestawienie danych dotyczących kinetyki procesów i przemian komórkowych. Obszarem badań niniejszej ekspertyzy był proces regulacji poziomu i określenie lokalizacji czynnika transkrypcyjnego – visfatyny.

Jest to znana adipokina, biorąca udział w szeregu przemian metabolicznych, głównie tkanki tłuszczowej, a od niedawna poznana jako jeden z czynników transkrypcyjnych powiązanych z aktywacją ścieżki sygnałowej zależnej od NFκB. Okazuje się, że oprócz funkcji hormonalnej, visfatyna powiązana jest z konserwatywnymi ścieżkami sygnałowymi wewnątrz komórki, prowadzącymi np. do zaprogramowanej śmierci – apoptozy. W trakcie procesu nowotworzenia, a później proliferacji komórek nowotworowych dochodzi do nadmiernej produkcji reaktywnych form tlenu (ROS). W cyklu komórkowym obserwuje się cykliczne wybuchy wolnych rodników, których źródłem są aktywnie pracujące w czasie podziału mitotycznego mitochondria – centra energetyczne komórki. Produktem ubocznym syntezy ATP są rodniki, które mogą doprowadzać do samouszkodzenia, czyli oksydacji makromolekuł komórkowych, w tym nośnika informacji genetycznej - DNA. Zaskakująca jest zatem nadprodukcja wolnych rodników w trakcie biosyntezy, czyli replikacji DNA, która ma miejsce tuż przed kolejnym podziałem komórki. Istnieje szereg wewnątrzkomórkowych indykatorów poziomu wolnych rodników i uszkodzeń nimi wywołanych w DNA, a w momencie przekroczenia ich maksymalnych poziomów uruchamiane zostają konserwatywne przełączniki decydujące o zahamowaniu dalszego podziału i uruchomieniu procesu samozniszczenia. Powiązanie visfatyny z nadprodukcją ROS i uruchomieniem procesu śmierci komórkowej było do tej pory mało poznane, dlatego w tej ekspertyzie podjęto się wykazania takiej zależności.
Wykonano szereg badań i oznaczeń związanych z określeniem poziomu wolnych rodników, w naturalnym cyklu komórkowym ludzkiej linii nowotworowej HCT 116, jak i w momencie zahamowania podziału toksyną – cytochalazyną B. Takie działanie miało doprowadzić do określenia faz produkcji ROS w cyklu podziałowym, przy równoczesnym określeniu poziomu białka visfatyny. Ekspresje visfatyny badano zarówno na poziomie transkryptu (mRNA), jak i funkcjonalnego białka (immunoznakowanie zlotem). Mikroskopia elektronowa dostarczyła niezbędnej informacji na temat lokalizacji visfatyny w cytoplazmie i w jądrze komórkowym, w zależności od funkcji, jaką adipokina w konkretnej fazie cyklu podziałowego pełni – w cytoplazmie przy niskim poziomie ROS i niskim prawdopodobieństwie uszkodzenia DNA lub w jądrze komórkowym przy replikacji DNA, gdy doszło do nadmiernego uszkodzenia DNA przez wysoki poziom ROS i ścieżka apoptozy, również przez visfatynę, zostaje uruchomiona.
Celem ekspertyzy było dokonanie, na podstawie zdjęć z transmisyjnego mikroskopu elektronowego, oceny lokalizacji czynnika transkrypcyjnego, jakim jest visfatyna w komórkach nowotworowych HCT 116. Dodatkowo opisano jej rolę w procesach związanych z produkcją wolnych rodników (ROS), przeżyciem komórek, proliferacją i zahamowaniem cyklu komórkowego po podaniu cytochalazyny B. Przeprowadzone badania i uzyskane wyniki wykazały wzajemną zależność pomiędzy regulacją cyklu komórkowego, a zachodzącymi w komórkach nowotworowych zmianami. Uzyskane wyniki mogą posłużyć zbudowaniu modelu sterowania wewnątrzkomórkowymi szlakami sygnałowymi, regulującymi podziały komórkowe oraz włączające ścieżkę apoptozy. W przypadku komórek nowotworowych może być to przydatne w poznawaniu fizjologii i patologii nowotworów.