Górnośląskie Centrum Obliczeń Naukowych i Inżynierskich

Ekspertyza ma na celu zbadanie wpływu różnych typów hipoksji (cyklicznej i chronicznej) na zmianę poziomu ekspresji genów w wybranych liniach komórkowych. W badaniu wykorzystano wielkoskalowe dane mikromacierzowe, które poddano analizie bioinformatycznej. Wyniki analizy pozwoliły na określenie sygnatur genowych mających ścisły związek z hipoksją cykliczną i chroniczną.

Niedotlenowanie (hipoksja) jest nieodłącznym elementem mikrośrodowiska nowotworowego, który towarzyszy większości rozwijających się guzów i znacząco pogarsza rokowanie chorych. Wyróżnia się dwa typy hipoksji: chroniczną, wynikającą z ograniczonej dyfuzji tlenu (ang. diffusion-limited hypoxia) oraz cykliczną, która jest efektem zmiennego przepływu krwi w guzie (ang. perfusion-limited hypoxia). Oba typy indukują agresywny fenotyp komórek nowotworowych oraz obniżają skuteczność stosowanych terapii. Podczas gdy wpływ hipoksji chronicznej (ciągłej) na komórki nowotworowe jest dość dobrze poznany, molekularne podstawy odpowiedzi na cykliczną hipoksję nie są dokładnie zbadane. Identyfikacja genów/białek specyficznie regulowanych w warunkach hipoksji cyklicznej pozwoliłaby nie tylko na bardziej precyzyjne obrazowanie hipoksji w guzach nowotworowych, ale również na lepsze zrozumienie roli hipoksji w progresji nowotworów.
W naszych badaniach komórki raka jajnika, prostaty oraz czerniaka poddaliśmy działaniu eksperymentalnej hipoksji (1% tlenu) chronicznej oraz cyklicznej (naprzemienne stany hipoksji i reoksygenacji) oraz warunkom kontrolnym (21% tlenu). Eksperyment wykonano w trzech powtórzeniach). Po 72 h traktowania całkowite RNA wyizolowane z komórek poddano analizie mikromacierzowej z wykorzystaniem macierzy GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix).
Uzyskane dane podano przetwarzaniu wstępnemu wykorzystując algorytm GC-RMA (GeneChip Robust Multiarray Averaging) wykorzystując dostępne biblioteki środowiska R i Bioconductor. Otrzymane ponad 19 000 zestawów sond przenanalizowano w celu identyfikacji genów różnicujących próbki eksperymentalne od kontrolnych ze szczególnym uwzględnieniem transkryptów specyficznie regulowanych w warunkach hipoksji cyklicznej. W analizie wykorzystano t-test Random Variance Model (RVM), f-TEST, MANOVA do porównania klas oraz GSEA do identyfikacji znamiennie zmienionych zestawów genów. Znamienność statystyczną wyznaczono dla p< 0.05 uwzględniając poprawkę na wielokrotne testowanie (Benjamini-Hochberg false discovery rate (FDR) multiple test correction).
Analiza pozwoliła zidentyfikować dla każdej linii listę genów, których ekspresja zmienia się preferencyjnie w warunkach hipoksji cyklicznej. W analizie ilościowej PCR potwierdziliśmy większość wyników uzyskanych dla wybranych sześciu genów (Il8, PLAU, EPHA2, AREG, CXCL2, HBEGF). Ponadto wskazano procesy komórkowe i ścieżki sygnałowe, które mogą być w większym stopniu modulowane przez hipoksję cykliczną niż cykliczną (np. replikacja, inwazyjność, odpowiedź immunologiczna, ścieżka EGF, AP-1). Dodatkowo wykonane badanie pozwoliło zidentyfikować nowe, wcześniej nie wiązane z hipoksją geny, których zmienioną ekspresję obserwowano we wszystkich trzech liniach komórkowych (nowe "uniwerslane" geny hipoksji). Uzyskane wyniki stanowią dobra podstawę do dalszych badań odpowiedzi komórkowej na hipoksję cykliczną.