Górnośląskie Centrum Obliczeń Naukowych i Inżynierskich

Wyprowadzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) z komórek somatycznych dało medycynie nadzieję na skuteczną walkę z wieloma chorobami. Do tej pory zostało opracowanych wiele sposobów produkcji komórek iPS mających na celu zmniejszenie ryzyka związanego z samym procesem reprogramowania, jednak ryzyko nowotworzenia w tkankach zróżnicowanych z IPS jest nadal poważne (Miura, Okada et al. 2009, Gutierrez-Aranda, Ramos-Mejia et al. 2010). Jednym z powodów, dla których komórki iPS mogą przekształcać się w komórki nowotworowe jest zastosowanie czynników transkrypcyjnych w procesie reprogramowania.

Dwa z nich: c-Myc i Klf4 oprócz tego, że wchodzą w skład tzw. “Yamanaka cocktail”, są także znanymi protoonkogenami, które odgrywają ważną rolę w samoodnowie komórek macierzystych. Klf4 koduje czynnik transkrypcyjny, który jest związany zarówno z represją nowotworu, jak i onkogenezą. Jako represor transkrypcji p53, Klf4 działa jak zależny od sytuacji. Zarówno Klf4 i c-Myc prowadzą także do zakłóceń replikacji DNA i niestabilności genomowej, co również świadczy o dużym podobieństwie między procesem indukowania pluripotencji, a nowotworzeniem.

 

Komórki iPS są pod wieloma względami podobne do macierzystych komórek nowotowrowych (CSCs), które stanowią nieliczną podgrupę komórek nowotworowych mających zdolność do samoodnawiania, tworzenia nowotworu oraz przerzutów (Reya, Morrison et al. 2001). Do tej pory obecność tych komórek udokumentowano w wielu typach nowotworów: piersi, mózgu, skóry, głowy i szyji, tarczycy, szyjki macicy, płuc oraz białaczki (Hombach-Klonisch, Paranjothy et al. 2008, Klonisch, Wiechec et al. 2008, Farahani E 2014, Wasik AM 2014). CSCs występują preferencyjnie w obrębie tzw. nisz mikrośrodowiskowych tkanki nowotworowej, gdzie mają ograniczony dostęp do tlenu. Obniżone stężenie tlenu ma kluczowe znaczenie dla samoodnowy CSCs, ich potencjału przerzutowego oraz oporności na terapię. Komórki te znane są również ze zwiększonego poziomu białek anty-apoptotycznych w stosunku do komórek tej samej tkanki, co po części wyjaśnia oporność CSCs na leki cytotoksyczne (Bitarte, Bandres et al. 2011, Ribatti 2012). Pochodzenie CSCs pozostaje nadal niejasne. Sądzi się, że CSCs tworzą się w procesie podobnym do reprogramowania, z komórek, które nabyły fenotyp bardziej przypominający komórki macierzyste. Druga teoria mówi, że powstały one z komórek macierzystych, w których nagromadziła się wystarczająca liczba mutacji wymaganych do transformacji nowotworowej. Możliwe jest również, że CSCs są wynikiem kombinacji obu tych mechanizmów.

 

Ze względu na duże podobieństwo komórek iPS do macierzystych komórek nowotworowych oraz ich skłonność do tworzenia nowotworów koniecznym jest poznanie podłoża molekularnego regulującego nowotworzenie w omawianych typach komórek.

 

Celem niniejszej ekspertyzy było zbadanie ekspresji genów związanych z nowotworzeniem, samoodnową oraz regulacją cyklu komórkowego w komórkach iPS, w komórkach nowotworowych i w macierzystych komórkach nowotworowych  oraz znalezienie czynników różnicujących wyżej wymienione typy komórek od siebie.

 

W badaniach skupiono się przede wszystkim  na porównaniu profili ekspresji 6-fosfofrukto-2-kinazy/ fryktozo-2,6-bifosfatazy 3 (PFKFB3) oraz fosfofruktokinazy-1 (PFK1). Do analizy ekspresji genów wykorzystano zmodyfikowaną metodę  2-ΔΔCt (Livak, 2001). W skrócie, dla każdego typu badanych komórek wybrano odpowiedni, wspólny kalibrator służący normalizacji ekspresji badanych genów (GAPDH). Określono także zakres, w którym ekspresja genów rośnie wykładniczo, ustawiono wartość progową, poniżej której sygnał fluorescencji probek jest szumem i obliczono wartości Ct. Następnie, aby określić krotność zmian, wartości ekspresji  porównywano w odpowiednich parach próbek.  Metodę Livaka zmodyfikowano także w taki sposób, aby w obliczeniach uwzględniała ona rzeczywistą wydajność reakcji PCR (w naszym przypadku pomiedzy 0.81, a 0.96).

 

Wykonane badania i obliczenia, wykazały iż ekspresje PFKFB3 i PFK1 umożliwiają rozróżnienie komorek iPS od CSCs, a także od komórek normalnych oraz nowotworowych. Wykazano również, iż komórki nowotworowe i iPS, kiedy hodowane są w warunkach hipoksji, zmieniają  poziom ekspresji PFKFB3 i PFK1 w taki sposób, że ekspresja genów przypomina tę jaka jest obserwowana w komórkach CSCs. W ramach ekspertyzy zbadano również różnice związane z danym typem komórek w odpowiedzi na farmakologiczne zachamowanie ekspresji PFKFB3.

 

Możliwość odróżnienia komórek macierzystych komórek nowotowrowych od komórek iPS oraz normalnych, za pomocą określenia ekspresji genów (oraz poziomu białek) i PFKFB3 i PFK1 poprawia perspektywy kliniczne dla zastosowania terapii opartych na komórkach macierzystych oraz pozwala na bardziej precyzyjne wykrywanie CSCs w badaniach onkologicznych.

 

 

Uzyskane w ramach prac nad ekspertyzą wyniki zostały wygłoszone jako referaty na dwóch międzynarodowych konferencjach. Ponadtwo wyniki badań zostały  opublikowane w czasopiśmie JCR (Oncotarget) o współczynniku oddziaływania równym 6.627 (wg wykazu JCR 2013).

 

 

wykonawca:

Artur Cieślar-Pobuda